Virologische Studien

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Virologische Studien sind Studien, die dazu dienen, Viren zu isolieren und ihre Eigenschaften zu untersuchen sowie den ätiologischen Zusammenhang von Viren mit bestimmten Krankheiten herzustellen.

Das Material für die Studie wird abhängig vom Ort der vorherrschenden Vermehrung von Viren im Körper des Patienten und von den Wegen ihrer Freisetzung in die äußere Umgebung genommen. Das Material wird in sterilen Schalen gesammelt, so schnell wie möglich ins Labor gebracht und bis zum Einfrieren in der Studie oder auf Eis gelagert. Vor der Verwendung wird das Virusisolationsmaterial mit Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) zur Unterdrückung der Mikroflora von außen behandelt und zur Entfernung großer Partikel zentrifugiert.

Die Isolierung der Viren erfolgt durch Infektion mit virushaltigem Material von Versuchstieren, Hühnerembryonen und Gewebekultur. Die Wahl der Isolierungsmethode hängt von dem erwarteten Erreger der Krankheit ab. Daher wird Gewebekultur (siehe) verwendet, wenn mit Viren gearbeitet wird, die für Labortiere nicht pathogen sind, oder wenn Viren in Gewebekulturen früher erkannt werden als bei einer Infektion von Tieren. Hühnerembryonen werden infiziert, um die Erreger der Influenza, der infektiösen Parotitis (in die Fruchtwasser- und Allantoinhöhlen), der Ornithose (in den Dottersack) und der Pocken (in die Chorioallantoismembran) zu isolieren.

Von Versuchstieren werden weiße Mäuse am häufigsten für die Virusisolation verwendet, dann Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und Affen. Bei Arboviren ist die Einführung eines virushaltigen Materials in das Gehirn oder das Rückenmark am wirksamsten, bei pneumotropen Viren - an der Schleimhaut der Atemwege, bei Pockenviren und Herpes - an der verstoßenen Hornhaut.

Die Virusisolation ist in der akuten Zeit der Krankheit am effektivsten. Ein wichtiger Punkt bei der Bestimmung der viralen Natur der Erkrankung sind die Ergebnisse serologischer Studien von Seren, die zu Beginn der Erkrankung und während der Erholungsphase wiederholt von demselben Patienten entnommen wurden. Der Nachweis von Antikörpern gegen die isolierten Viren im zweiten Serum im Titer beträgt 4 und mehr als im ersten, was auf den ätiologischen Zusammenhang der Viren mit der gegebenen Krankheit hinweist.

Eine frühe und schnelle Methode zum Nachweis viraler Antigene ist die Fluoreszenz-Antikörpermethode, die auf der spezifischen Fixierung von mit Fluorochromen markierten Antikörpern auf der Oberfläche des Antigens basiert. Antigen lässt sich leicht durch Fluoreszenzmikroskopie (siehe) aufgrund der starken Fluoreszenz der auf dem Antigen adsorbierten Antikörper nachweisen. Die Methode der fluoreszierenden Antikörper untersuchte Abstriche von Patienten, histologische Schnitte der betroffenen Gewebe, Präparate aus Gewebekultur. Elektronenmikroskopie wird auch zum Nachweis von Elementarkörpern (Virionen) eingesetzt (siehe). Von anderen morphologischen Methoden werden diejenigen verwendet, die intrazelluläre virale Einschlüsse in Abschnitten von betroffenen Organen und Geweben nachweisen. Der Nachweis von Einschlüssen weist auf eine Infektion hin und trägt in einigen Fällen zur Diagnose einer Viruserkrankung bei. Verschiedene serologische Tests werden verwendet, um virale Antikörper im Blut von Patienten nachzuweisen und die antigene Struktur von Viren zu untersuchen. Die Neutralisationsreaktion wird bei fast allen Virusinfektionen angewendet. Es basiert auf der Fähigkeit von Immunserumantikörpern, die infektiösen Eigenschaften von Viren zu neutralisieren, wenn die Mischung in anfällige Tiere oder Gewebekultur eingebracht wird. Zur Bestimmung des Neutralisationsindex wird eine konstante Serumdosis mit verschiedenen Verdünnungen von Viren gemischt, und zur Bestimmung des Antikörpertiters - verschiedene Verdünnungen des Serums mit konstanter Virendosis. Die Kontrolle ist die Infektion von Tieren (oder Gewebekulturen) mit einer Mischung von Viren mit normalem Serum oder mit Salzlösung. Die Neutralisationsreaktion dient nicht nur zum Nachweis von Antikörpern, sondern auch zum Bestimmen des Typs und des Typs der Viren.

Die Komplement-Bindungsreaktion [zum Beispiel Bordet-Zhangu-Reaktion (siehe)] wird verwendet, um sowohl virale Antigene als auch Antikörper nachzuweisen. Im ersten Fall sollen das bekannte Immunserum und das Material, in dem die Anwesenheit von Antigenen in die Reaktion eingreifen soll: Blutserum, Nasopharynx-Waschungen, Gewebeextrakte des infizierten Organismus. Im zweiten Fall - ein bekanntes Antigen (Diagnostikum) und Serum des Patienten oder Genesenden.

RAC wird zur Diagnose von Krankheiten verwendet, die durch Viren von Influenza, Pocken, Polio, Mumps, Adenoviren und Arboviren verursacht werden.

Die Fällungsreaktion in Agar basiert auf der Bildung eines Fällungsstreifens an der Kontaktstelle des Antigens mit Antikörpern in der Agarschicht zwischen den mit viralem Antigen gefüllten Vertiefungen und Immunserum. Die Reaktion dient zur Untersuchung der antigenen Struktur von Viren und zur Diagnose einiger Infektionen - Pocken, Polio, Epidemiehepatitis.

Die Hämagglutinationsreaktion, basierend auf der Fähigkeit vieler Viren, Agglutination (Bindung) der roten Blutkörperchen verschiedener Tiere (Hühner, Gänse, Meerschweinchen) und Menschen zu verursachen, wird zum Nachweis von Viren verwendet. Antivirales Serum hemmt die hämagglutinierende Aktivität von Viren, und dieses als Hämagglutinationshemmungsreaktion (HI) bezeichnete Phänomen wird häufig zur Diagnose von Influenza, Mumps, Pocken und einigen Enzephalitiden eingesetzt.

Virologischer Bluttest

VIRUS RESEARCH - Forschung zur Diagnose von Virusinfektionen, zur Untersuchung der relevanten Krankheitserreger, ihrer Verteilung in der Natur sowie bei der Herstellung von Virusmedikamenten. In Virologielabors (siehe) Honig. Sie untersuchen sowohl humane Viren als auch in manchen Fällen auch tierische Viren (zum Beispiel Tollwut bei Hunden diagnostizieren, Tiere untersuchen, die zur Herstellung von Viruspräparaten verwendet werden). Die Forschungsmethoden dieser und anderer sind ähnlich.

Eine der Hauptstufen von V. und. ist die Isolierung von Viren. Bei der Isolierung von Viren von Menschen, Blut, verschiedenen Geheimnissen und Ausscheidungen werden Organstücke verwendet. Am häufigsten wird Blut auf Arbovirus-Erkrankungen untersucht. Es wird ganzes defibriniertes oder hämolysiertes Blut verwendet, seine einzelnen Elemente oder Gerinnsel (in späteren Stadien der Erkrankung). Tollwutviren, Epid, Parotiditis, Herpes simplex können im Speichel gefunden werden. Nasopharynx-Waschungen werden verwendet, um die Erreger von Influenza, Masern, Psittakose, Rhinoviren, respiratorischem Synzytialvirus und Adenoviren zu isolieren. Adenoviren finden sich auch in den Waschungen der Konjunktiva. Die Spülung erfolgt durch Spülen der Nase und des Rachens (separat) und Waschen der Bindehaut mit einer isotonischen Natriumchloridlösung. Sie können die Nasengänge und die mit Brühe angefeuchtete Rückseite des Rachenabstrichs abwischen. Nicht steriles Material wird 30 Minuten lang mit Antibiotika (1000 IE Penicillin und Streptomycin pro 1 ml) behandelt. Verschiedene Enteroviren, Adeno- und Reoviren unterscheiden sich von Kot. Proben wurden 1:10 mit Phosphatpuffer verdünnt und zweimal für 20 Minuten zentrifugiert. bei 8000 U / min I Antibiotika werden wie oben zugegeben. Weniger oft für V. und. Nehmen Sie den Inhalt von Pusteln (mit Pocken, Windpocken, Herpes) und punktierten Organen (mit Geschlechtslymphanulom). Schnittmaterial sollte so schnell wie möglich nach dem Tod des Organismus genommen werden. Es wird bis zum Zeitpunkt der Untersuchung bei t ° -20 ° und darunter aufbewahrt. Zur Durchführung von V. und. Das Gewebe wird zerkleinert (zerstoßen) und eine 10–20% ige Suspension wird auf einer isotonischen Lösung von Natriumchlorid oder einem Kulturmedium für Zellkulturen hergestellt. Es wird 20 Minuten lang zentrifugiert. bei 1500 rpm; Der Überstand wird für weitere Untersuchungen verwendet.

Um Viren zu isolieren, werden Labortiere, Vogelembryonen, Zell- und Gewebekulturen infiziert. Tiere sind nützlich, wenn das Virus zu eindeutigen klinischen Symptomen der Krankheit oder zu pathologischen Veränderungen (z. B. Lähmung, Lungenentzündung usw.) führt. Vom Tropismus des Virus hängt die Wirksamkeit eines Verabreichungsweges des Materials ab. Weit verbreitete Infektion unter der Haut, intraperitoneal und intravenös. Neurotrope Viren werden entdeckt, wenn Tiere in den Gehirnhälften (Arboviren, Tollwutvirus usw.), einem sichtbaren Hügel (Poliovirus in Affenversuchen) und im Rückenmark infiziert werden. Pocken- und Herpesviren können durch Anbringen von Material an Kaninchen auf einer verstoßenen Hornhaut nachgewiesen werden. Einige Viren sind leicht zu entdecken, wenn sie in die vordere Augenkammer geimpft werden (z. B. Hepatitis-Virus bei Hunden). Die intranasale Infektion von Tieren wird gewöhnlich verwendet, um die Erreger von Atemwegsinfektionen zu untersuchen (Instillation in die Nase von betäubten Tieren oder deren Einführung in Form eines Aerosols in einer speziellen Kammer). Das Material wird mit Nahrung in den Verdauungstrakt oder mit einer stumpfen Nadel durch den Mund eingebracht. Bei der Untersuchung einiger onkogener Viren wird die Methode der Infektion von Goldhamstern in die Schleimhaut von Backenbeuteln verwendet.

Für viele Viren sind Neugeborene und Sauger anfälliger als geschlechtsreife Personen. Saugmäuse werden häufig verwendet, um Arboviren und Coxsackie-Viren (nach einer Infektion im Gehirn) zu isolieren. Einige Adenoviren können durch subkutane Infektion neugeborener Goldhamster Tumore induzieren. Die Untersuchung einer Reihe von Vogelviren wird an Hühnern der ersten Lebenstage durchgeführt.

Die Verwendung von Hühnerembryonen hat mehrere Vorteile. Ihr undifferenziertes Gewebe weist eine breite Empfindlichkeit gegen viele Viren auf. Das Vorhandensein einer Infektion wird nach dem Tod von Embryonen, dem Auftreten von Veränderungen (Ospin) an der Chorion-Allantoismembran (1), der Anhäufung von Hämagglutininen in den Embryonalflüssigkeiten und dem komplementbindenden viralen Antigen beurteilt. Embryonen auf der Chorioallantoismembran (im Alter von 11–12 Tagen mit Viren der Pockengruppe), in den allantoischen und amniotischen Höhlen (10–11 Tage alte Myxoviren), der Dottersack (im Alter von 5–6 Tagen, Erreger der Psittakose und andere) sind infiziert. Material wird selten in das Gehirn und intravenös (in die Gefäße der Membranen) geimpft. Bei jeder Infektionsmethode können die Embryonen traumatisiert werden und sind daher innerhalb der ersten 24 bis 48 Stunden tot. von der Buchhaltung ausgeschlossen.

Um die Wirkung auf Viren chemisch zu untersuchen. Substanzen sind sehr günstig dembrirovannye Eier, die den Embryo entfernt, aber Chorioallantoic-Schale erhalten. Ein Virus und eine Testsubstanz werden in eine 20 ml isotonische Lösung von Natriumchlorid gegeben. Das Loch in der Schale wird mit einer Kappe mit einem Schlauch verschlossen, durch den Sie Proben zur Analyse entnehmen können.

Bei der Bewertung von Versuchen an Tieren und Embryonen von Vögeln sollte man die Möglichkeit berücksichtigen, darin latente Infektionen hervorzurufen oder ein latentes Virus zu isolieren.

Ausnahmsweise weit verbreitet für die Isolierung und Akkumulation von Viren verwendeten Zellkulturen und Gewebe (siehe). Diese Methoden können die meisten bekannten Viren kultivieren (siehe Kultivieren von Viren). Einige von ihnen werden bereits während der Erstinfektion von Kulturen intensiv akkumuliert, für die Anpassung anderer sind mehrere Passagen erforderlich. Die Vermehrung der meisten Viren in Zellkulturen geht einher mit der Entwicklung einer zytopathischen Wirkung. Von Natur aus kann man beurteilen, ob Viren zu einer oder einer anderen Gattung gehören: Picornaviren verursachen Rundung und Faltenbildung von Zellen, Adenoviren - die Bildung von Trauben in Form von Weintrauben, Myxoviren und herpetische Viren - die Bildung von mehrkernigen Synzytien. Eine Reihe von Viren können nicht außerhalb des Körpers kultiviert werden.

Die Reproduktion einiger Viren (Pockengruppe, Myxo- und Arboviren) kann durch Hämadsorption nachgewiesen werden, da die betroffenen Zellen die Fähigkeit besitzen, Erythrozyten zu adsorbieren. Entsprechende Erythrozyten (Menschen, Affen, Meerschweinchen, Hühner) in einer Konzentration von 0,4–0,5% werden bei t ° 4 ° oder 20–30 Minuten bei einer Monoschicht angeordnet. Erythrozyten adsorbieren diffus in der Kultur (z. B. Para-Influenza-Viren) oder bilden Inseln (Grippeviren, Mumps).

Die Virusvermehrung wird manchmal durch Untersuchung der Kulturflüssigkeit bei Tieren (durch Zecken übertragene Enzephalitis) oder bei CSC beurteilt. Das Vorhandensein eines Virus, das keine zytopathische Aktivität besitzt, wird manchmal durch seine Fähigkeit, mit dem zytopathogenen Virus zu interferieren, bestimmt. Daher wird in Zellkulturen von Embryonen von Hühnern, die mit Vogel-Leukämieviren infiziert sind, die Reproduktion des Rous-Sarkomvirus gehemmt. Zum Nachweis nicht-zytopathogener Stämme von Rinderdiarrhoe und Schweinecholera-Viren wird eine END-Methode (Exaltation of Newcastle Disease Virus) vorgeschlagen - Superinfektion von Kulturen des Newcastle Disease Virus. Mit der gemeinsamen Wirkung beider Viren tritt eine Zellzerstörung auf.

Wenn zytopathische Veränderungen oder andere Anzeichen einer Virusvermehrung auftreten, wird die Kulturflüssigkeit verwendet, um das Virus oder die Passage zu identifizieren. Eine Reihe von Viren bleibt auch während der Kulturdegeneration (Adenoviren, Viren der Pockengruppe) mit Zellen assoziiert, wodurch das Einfrieren und Auftauen der Kulturen vor dem Sammeln der Flüssigkeit erfolgt. Einige Herpesviren, zum Beispiel das Marek-Virus bei Hühnern, müssen zusammen mit intakten Zellen neu gepflanzt werden.

Um die respiratorischen Koronaviren von Menschen und einigen anderen zu untersuchen, verwenden sie das Gewebekulturverfahren, d. H. Die Infektion von in vitro kultivierten Gewebefragmenten. Die häufigste Verwendung ist Kaninchen-Trachea-Gewebe. Das Zuchtvirus infiziert die Schleimhautendothelzellen, was durch die Beendigung der Flimmerbewegung bestimmt wird.

Das Vorhandensein von Fremdviren in Gewebekulturen und Zellen sollte berücksichtigt werden. Sie können mit Zellen angewendet werden, wenn sie aus einem infizierten Organismus stammen, aus Trypsin oder Serum, das für die Kultur von Zellen verwendet wird.

Neben der Aussaat von Biopsie oder Schnittmaterial auf bereits gezüchteten Kulturen wird nach der Trypsinisierung die direkte Kultivierung der Zellen des untersuchten Organs verwendet, was häufig hinsichtlich der Virusisolation (z. B. Nachweis von Adenoviren in den Mandeln) wirksamer ist. Die Methode der Mischkulturen wird auch angewendet, wenn Zellen des untersuchten Organs zusammen mit irgendwelchen Zellen, die für dieses Virus empfindlich sind, gezüchtet werden (z. B. Aussaat von Gehirnzellen von Patienten mit subakuter sklerosierender Panencephalitis zusammen mit Affennierenzellen oder Hela-Zellen, um das Masernvirus zu isolieren). Die Mischkulturmethode ist oft die einzige Möglichkeit, ein Virus aus tierinduzierten Tumoren zu isolieren, die kein aktives Virus produzieren, sondern ein virales Genom enthalten.

Einschichtige Zellkulturen ermöglichen es, Kolonien der Virusplaque zu erhalten (Abb. 2). In der Regel bilden Plaques Viren mit zytopathischer Aktivität. Gleichzeitig erlaubt diese Methode den Nachweis einiger nicht-zytopathogener Viren (z. B. einer Reihe von Rinderdiarrhoe-Virenstämmen). Um Plaques zu erhalten, wird das Virus in Bechern oder flachen Ampullen auf eine Zellmonoschicht aufgebracht. Die Vielzahl der Infektionen, d. H. Die Anzahl der Viruspartikel pro Zelle, muss gering sein, damit die gebildeten Plaques nicht miteinander verschmelzen. Nach 30-60 Minuten Adsorptionsschichten Nährmedium mit 1,35 - 1,5% Agar und Neutralrot in der Endverdünnung von 1: 40 000. Kulturen in Petrischalen werden in einer Atmosphäre mit 5-10% Kohlendioxid und hermetisch verschlossenen Phiolen in einem herkömmlichen Thermostat inkubiert. Nach einigen Tagen beginnen sich ungefärbte Herde entarteter Zellen unter in vivo gefärbten Zellen abzuheben.

Es ist möglich, Agar ohne Neutralrot auf die Zellen zu bringen und nach einigen Tagen eine zweite Schicht Farbstoffagar aufzutragen; Plaques werden nach wenigen Stunden sichtbar. Agar enthält manchmal Polysaccharidsulfate, die das Wachstum von Viren hemmen. Um sie zu neutralisieren, wird dem Medium Protaminsulfat (60 mg pro 100 ml) zugesetzt. Um Plaques einer Reihe von Viren zu erhalten, können Methylcellulose und andere Substanzen als Beschichtung verwendet werden. Einige Viren (Pocken, Masern) bilden auch ohne Agar Plaques. Die Plaque-Methode ermöglicht die klonale Analyse von Virusstämmen. Um genetisch homogene Klone zu isolieren, wird eine Platte entfernt, die für die nächste Infektion verwendet wird. Normalerweise wird das Klonen für drei Passagen durchgeführt.

Das Plaque-Verfahren eignet sich auch zur Bestimmung der Anzahl von Zellen, die ein Virus in einer infizierten Kultur produzieren (d. H. Die Anzahl der Infektionszentren). Dazu werden die Zellen suspendiert, auf eine einschichtige Kultur von virusempfindlichen Indikatorzellen gestellt und mit Agar gefüllt. Plaques bilden sich um die infizierten Zellen.

Zur Diagnose von Virusinfektionen und zur Untersuchung der antigenen Struktur von Viren wird eine Gelfällungsreaktion verwendet. Agar wird meistens für diesen Zweck verwendet. Antigene und spezifische Antikörper, die sich in einem bestimmten Abstand auf einem Agargel befinden, diffundieren und bilden beim Treffen einen Niederschlag in Form von weißen Streifen. 0,8-1% Agar in einer isotonischen Lösung von Natriumchlorid oder Phosphatpuffer wird in die Kapillaren gegeben oder auf einen Glasträger gestellt. Antigene haben vorzugsweise gereinigt und konzentriert. Die Bestandteile der Reaktion werden auf den Agar in den gegenüberliegenden Enden der Kapillare oder in den in der Agarschicht auf den Gläsern hergestellten Vertiefungen in einem Abstand von 5-6 mm aufgetragen. Die Inkubation dauert 4-20 Stunden.

Eine bedeutende Anzahl von B. und. unter Verwendung von Licht- und Elektronenmikroskopie durchführen. Die größten Viren (zum Beispiel Pocken) nach entsprechender Verarbeitung (Versilbern, Malen von Victoria und anderen) können durch herkömmliche Lichtmikroskopie nachgewiesen werden. Diese Methode wird bei der Pockendiagnostik durch Untersuchung von Pusteln verwendet. Charakteristisch für einige Infektionen ist die Bildung von Zellen in den Zellen - Einschlüsse. So treten bei Herpes- und Adenovirus-Infektionen Einschlüsse in den Kernen auf, im Zytoplasma - in Pocken (Guarnieri-Kalb) und Tollwut (Babesh-Body - Negri). Der Nachweis von Einschlüssen ist wichtig für die Diagnose von Tollwut, Pocken, Zytomegalie, subakuter sklerosierender Panencephalitis usw.

Mikroskopie im Dunkelfeld (vgl. Dunkelfeldmikroskopie) und Phasenkontrastmikroskopie (siehe) verwenden hl. arr. um die Dynamik von Veränderungen in virusinfizierten Zellen zu untersuchen. Weiter verbreitete Fluoreszenzmikroskopie (siehe).

Untersuchen Sie Abstriche, Drucke und einschichtige Zellkulturen auf Glas. Präparate (nativ oder fixiert) werden meistens mit orangefarbenem Acridin angefärbt. Das Verfahren ermöglicht die Erkennung großer Viren und Cluster von Viruskomponenten. Formationen, die DNA enthalten, leuchten mit einem hellgrünen Licht, und solche, die RNA enthalten, sind ziegelrot. Öfter mit V. und. die Verarbeitung infizierter Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern durchführen, um Cluster von viralem Antigen zu identifizieren. Bei der direkten Methode wird ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat, markiertes Immun-Gammaglobulin verwendet. Bei der indirekten Methode wird das Arzneimittel mit normalem Immunserum eines beliebigen Tieres behandelt und dann mit Antikörpern gegen das Gammaglobulin dieses Tieres markiert. Die Präparate werden im ultravioletten Licht untersucht, das virale Antigen wird durch ein leicht grünes Glühen nachgewiesen (siehe Immunfluoreszenz). Die Methode der Abstriche aus dem Nasopharynx ermöglicht die frühzeitige Diagnose von respiratorischen Virusinfektionen - Influenza, Parainfluenza, Rhino- und Adenovirus, respiratorisches Synzytial.

Mit der Elektronenmikroskopie (siehe) können Sie die Größe und Struktur von Viruspartikeln sowie die geringfügigen Veränderungen in den Zellen untersuchen. Untersuchen Sie die Virussuspension oder die ultradünnen Schnitte infizierter Zellen. Einige Viren (z. B. eine Reihe von Oncornaviren von Menschen und Tieren) können mit dieser Methode nur in Geweben nachgewiesen werden.

B. und., Deren Zweck es ist, die Menge (Titer) eines Virus oder viraler Antikörper zu bestimmen, ist sehr unterschiedlich.

Unter einem Elektronenmikroskop kann die Anzahl der Viruspartikel in einer Suspension berechnet werden, wenn diese ausreichend sauber ist. Das Virus wird mit Polystyrollatex gemischt, die Anzahl der Partikel ist bekannt. Die Mischung wird auf das Gitter gesprüht, die Anzahl der Partikel in separaten Tropfen zählen. Das Verhältnis der Anzahl der Latexpartikel und der Viren zeigt die Anzahl der Virionen in einem bestimmten Volumen. Diese Methode gibt keine Vorstellung von der infektiösen Aktivität des Virus, da die Virussuspension normalerweise eine signifikante Anzahl nicht infektiöser Partikel enthält.

Am genauesten bestimmen die Anzahl der infektiösen Einheiten im Material die Methode der Plaques. Einschichtige Zellkulturen infizieren eine kleine Dosis des Virus. Der Titer wird durch die Anzahl der Plaque bildenden Einheiten (PFU) in 1 ml ausgedrückt. In ähnlicher Weise ist es möglich, den Titer einiger onkogener Viren anhand der Transformationsherde sowie der Erreger zu bestimmen, die auf der Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen (z. B. Pockenvirus) Pocken bilden.

Die Bestimmung des Virustiters durch die Methode der endlichen Verdünnung ist weniger genau. Zunehmend ansteigende Verdünnungen (normalerweise zehnfach) werden empfindlichen Tieren, Hühnerembryonen oder Zellkulturen injiziert. Wenn das Ergebnis jeder Verabreichung als positiv oder negativ angesehen wird, bestimmen sie die niedrigste Dosis des Virus, die eine bestimmte Wirkung hervorrufen kann (Krankheit oder Tod des Tieres, Auftreten von zytopathischen Veränderungen in der Kultur usw.). In der Praxis ist diese Dosis schwer zu bestimmen. Berechnen Sie daher die Dosis, die einen 50% igen Effekt ergibt (ED50). Sie wird abhängig von den Eigenschaften des Virus und der Titrationsmethode anhand der Anzahl der toten Tiere (LD50) die Anzahl der Fälle (ID50) die Anzahl der Embryonen, in denen virale Hämagglutinine oder komplementbindende Antigene auftraten, entsprechend der Anzahl der Zellkulturen, bei denen zytopathische Veränderungen oder hämadsorbierende Aktivität nachgewiesen wurden. Der Titer wird durch die Anzahl von ED 50 in einem bestimmten Materialvolumen ausgedrückt.

Von den bestehenden Verfahren zur Berechnung des ED50 wird am häufigsten das auf dem Kumulationsprinzip basierende Reed-Munch-Verfahren verwendet. Es basiert auf der Annahme, dass jedes Testobjekt (Maus, Embryo), das positiv auf die Einführung dieser Verdünnung reagierte, mit einer positiven Reaktion auf die Einführung eines stärker konzentrierten Virus reagieren würde. Wenn umgekehrt diese Verdünnung eine negative Reaktion auslöst, tritt mit der Einführung einer größeren Verdünnung auch eine negative Reaktion auf. Die Intervalle zwischen den Verdünnungen mit dieser Methode sollten gleich sein, mindestens 4 Tiere (Kulturen) werden mit jeder Verdünnung infiziert. Als nächstes interpolieren Sie zwischen den Dosen, wodurch der Effekt dem Wert von 50% am nächsten kommt. Die Berechnung erfolgt nach der Formel:

wobei B die kleinste Dosis ist, die bewirkt hat, dass die Wirkung mehr als 50% beträgt, b die Wirkung der Dosis B in Prozent ist und die Wirkung der höchsten Dosis, die die Wirkung verursacht hat, weniger als 50% beträgt, in Prozent, d das Intervall zwischen den Logarithmen zweier benachbarter Dosen.

Viren mit ausgeprägter zytopathischer Aktivität (zum Beispiel das Poliovirus) können mit einem Farbtest titriert werden. Sie beruht auf der Tatsache, dass während des Wachstums von Zellen der pH-Wert des Mediums abnimmt, und in infizierten Kulturen, in denen die Zellen entarten, ändert sich der pH-Wert des Mediums nicht. Um diese Veränderungen zu identifizieren, wird dem Medium ein Indikator hinzugefügt - Phenolrot, das bei pH über 7 rot, bei pH 7 orange und bei pH unter 7 gelb ist. In einem Nährmedium mit einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4 wird Phenolrot mit einer Endkonzentration von 1: 40.000 eingeführt.Die minimale Dosis von Zellen, die die Farbe des Mediums von rot nach gelb ändern (normalerweise etwa 25.000 in 0,25 ml), wird bestimmt. Als nächstes bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung des Virus vor, die jeweils in 4-6 Gefäße gegossen wird, die eine Zellsuspension hinzufügen. Die Röhrchen werden mit Gummistopfen verschlossen oder 0,6-0,8 ml Vaselineöl gegossen. Die Ergebnisse werden nach 5-7 Tagen bei 37 ° C berücksichtigt. Der Virustiter wird als Verdünnung genommen, wodurch verhindert wird, dass sich der pH-Wert in 50% der Reagenzgläser auf die saure Seite verlagert.

Die Fähigkeit von Immunseren, die infektiöse Aktivität von Viren zu neutralisieren, wird unter Verwendung einer Neutralisationsreaktion bestimmt. Serumtitrationsmethoden werden durch Titrationsmethoden für die jeweiligen Viren vorbestimmt. Alle basieren auf der Herstellung von Virusgemischen mit Serum, die dann auf das Vorhandensein eines neutralisierten Virus getestet werden. Die Reaktion wird in zwei Versionen eingestellt. Gemäß einem von ihnen wird das Immun- und normale Serum in einer Verdünnung (z. B. 1:10) mit steigenden 10-fachen Verdünnungen des Virus in einem gleichen Volumen gemischt und der Virustiter in Gegenwart des einen und des anderen Serums bestimmt. ED-Quotient50 Das Virus in Gegenwart von normalem Serum auf seinem ED50 in Gegenwart eines Immunoservers ist der Neutralisationsindex einer gegebenen Verdünnung des Immunserums. Es ist unmöglich, dieses Ergebnis für andere Verdünnungen des Serums zu interpolieren (z. B. ist die Aktivität von unverdünntem Serum höher als die berechnete). Alternativ kann eine konstante Dosis des Virus (normalerweise etwa 100 ED50) verbinden mit einer Anzahl zweifacher Verdünnungen des Testserums. Der Serumtiter wird verdünnt, wobei das Krim-Virus einen 50% igen Effekt verursacht.

Abhängig von der Titration des Virus wird die Neutralisationsreaktion an Labortieren, Hühnerembryonen (nach ihrem Tod oder einer Anhäufung von Hämagglutininen), an Zellkulturen (bei Auftreten von zytopathischen Veränderungen, Farbtest usw.) durchgeführt. Wenn das Virus auf der Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen Ospins bildet, wird die höchste Serumverdünnung bestimmt, wodurch die Anzahl der Ospine um 50 Prozent oder mehr verringert wird. In ähnlicher Weise wird Serum titriert, indem die Anzahl der viralen Plaques auf Monolayer-Zellkulturen verringert wird.

Die Titration von Viren durch DSA und Antikörper durch RTGA basiert auf der Fähigkeit einer Reihe von Viren (Myxoviren, einigen Mitgliedern des Pockenvirus, Adenovirus, Picornavirus und Togavirus-Viren), rote Blutkörperchen zu verkleben. Das Virus wird in zweifachen Verdünnungen mit einem gleichen Volumen von 0,5-1% Erythrozytensuspension titriert. Für den Titer (1 AE - Agglutination Unit) nehmen Sie die größte Verdünnung, die zur Hämagglutination führt (siehe). Der hämagglutinierende Virustiter ist kein Indikator für seine infektiöse Aktivität, da Hämagglutination nicht infektiöse "unvollständige" Partikel, ein inaktiviertes Virus und ein hämagglutinierendes Antigen verursachen kann, das von bestimmten Viren getrennt werden kann. RTGA-Seren werden in zweifacher Verdünnung mit 2-4 AE-Virus titriert; der Titer wird als die größte Verdünnung angesehen, die die Hämagglutination vollständig hemmt).

Einige Viren sind an roten Blutkörperchen adsorbiert, verursachen jedoch keine Agglutination. Um sie zu identifizieren, können Sie die Reaktion der indirekten Hämagglutination verwenden. Es basiert auf der Agglutination von mit Virus beladenen Erythrozyten mit für dieses Virus spezifischem Serum. Diese Methode wird hauptsächlich zur Titration von Seren verwendet.

Die Komplementfixierungsreaktion (siehe) eignet sich für die Titration von Viren (genauer gesagt komplementbindenden viralen Antigenen) und Antikörpern. CSC mit Viren unterscheidet sich grundsätzlich nicht von bakteriellen und anderen Antigenen. Unterschiede bestehen nur in der Methode der Antigenherstellung. Als virale Antigene können Blut, Nasopharynx-Wäschen, Urin, Kot von Patienten, Suspensionen infizierter Organe, Teile infizierter Hühnerembryos und eines in Zellkulturen gezüchteten Virus dienen. Die am besten geeigneten kulturellen Antigene. Die Suspension infizierter Organe vor der Verwendung wird wiederholt eingefroren und aufgetaut, mit einem gleichen Volumen Ether oder Chloroform vereinigt, 1-2 Stunden geschüttelt und dann 18-20 Stunden inkubiert. bei t ° 4 ° einfrieren, auftauen und durch Zentrifugieren aufhellen. Um Seren zu erhalten, sollten Tiere nicht mit einem Virus immunisiert werden, das in demselben Substrat wie das Antigen für die Reaktion kultiviert wurde. Abhängig vom Zweck der Titration werden Doppelverdünnungen des Antigens mit einer bestimmten Serumdosis oder umgekehrt Doppelverdünnungen des Serums mit einer einzelnen Antigendosis kombiniert. Der Kontakt des Antigens, des Serums und des Komplements wird für 1 Stunde bei 37 ° C oder 18 Stunden durchgeführt. bei t ° 4—6 °. Nach Zugabe des Hämosystems wird das Material 30 Minuten inkubiert. bei t ° 37 °. Bewertung der Ergebnisse nach den allgemeinen Regeln.

Es gibt Verfahren zum Titrieren von Viren und Antikörpern basierend auf der Indikation des Virus in infizierten Kulturzellen mit fluoreszierenden Antikörpern sowie einer Reihe anderer, die recht selten verwendet werden.

Die toxische Wirkung, die ein Nek-Eye für Viren besitzt, zeigt sich in ungewöhnlicher Weise bei der Verabreichung von Tieren mit hohen Dosen. Bei Krom durchläuft das Virus keinen vollständigen Reproduktionszyklus. So wird das Grippevirus beispielsweise Mäusen im Gehirn oder intravenös injiziert. Seine toxischen Wirkungen werden anhand des Todes von Tieren am ersten Tag beurteilt.

Die Antigenaktivität des Virus (oder Impfstoffs) wird durch Immunisierung von Menschen oder Tieren festgestellt, gefolgt von der Bestimmung des Antikörpertiters in ihrem Serum. Die immunogene Aktivität des Impfstoffs, d. H. Die Fähigkeit, Resistenz gegen Infektionen zu induzieren, wird durch Immunisierung empfindlicher Tiere gegen das Virus bestimmt. Dann werden immunisierte Tiere und nichtimmunisierte Kontrolltiere mit einer Reihe von Virusverdünnungen infiziert, wobei deren ED50 für beide Gruppen definiert wird. Der Unterschied in den erhaltenen Indikatoren kennzeichnet die Immunogenität des Testarzneimittels. Wenn das Virus keine Pathogenität für Tiere besitzt, kann die Immunogenität des entsprechenden Impfstoffs nur in Epidemiol bestimmt werden. Erfahrung

Um eine Reihe von Eigenschaften von Viren (Größe, Struktur, chemische Zusammensetzung usw.) zu untersuchen, ist es notwendig, gereinigtes Material mit einem hohen Titer zu haben. Das am häufigsten verwendete Virus wird in Zellkulturen oder in Form von Allantoinflüssigkeit infizierter Hühnerembryonen gezüchtet. Die Reinigung beginnt in der Regel mit der Differenzialzentrifugation: Zuerst wird das Material bei 15–20 Tausend g (g - Beschleunigung der Schwerkraft) von Zellbruchstücken befreit, und bei 50–100 Tausend g - das Virus selbst wird ausgefällt. Die Filtration durch Asbestdichtungen (wie Seitz), Glas- und Cellulosemembranfilter (wie Millipore-Filter) wird auch verwendet, um große Partikel zu entfernen. Fragmente, die kleiner als Viren sind, können durch Filtern des Materials durch Sephadex-Gele entfernt werden, die in Abhängigkeit von der Porengröße Partikel einer bestimmten Größe zurückhalten. Durch Aussalzen mit Hilfe von Ammonium- und Natriumsulfaten, Ausfällen mit Alkohol, Aluminiumhydroxid oder Polyethylenglykol wird das Virus aus großen Mengen isoliert und konzentriert. Zur Freisetzung aus Ballastproteinen wird auch deren Verdauung mit proteolytischen Enzymen eingesetzt. Myxoviren können durch Adsorption an Erythrozyten bei niedriger Temperatur und Elution bei höherer Temperatur gereinigt und konzentriert werden.

Weitere Reinigung und Konzentration des Virus durch eine oder andere Fraktionierungsmethode hergestellt. Diese Verfahren werden auch verwendet, um Mutanten des Virus und einzelne Viruskomponenten zu trennen. Wenn ein Virus mit einem aus wässrigen Lösungen von zwei Polymeren gebildeten Phasensystem gemischt wird, gelangt es in eine der Phasen, abhängig von seiner Größe, der Ionenzusammensetzung des Mediums, dem pH-Wert usw. Zum Reinigen großer Viren verwenden sie üblicherweise das System Dextransulfat-Methylcellulose, Neben-Dextransulfat mit Polyethylenglykol. Polymere, die nach der Phasentrennung zurückbleiben, werden häufig während des Prozesses der weiteren Reinigung des Virus entfernt. Sie können Dextransulfat auch durch Zugabe von Kaliumchlorid, Methylcellulose mit Ammoniumsulfat, Polyethylenglykolchloroform und anderen Methoden entfernen.

Die Reinigung von Viren mittels Säulenchromatographie beruht auf ihrer Fähigkeit, eine Reihe von Substanzen zu adsorbieren und bei pH-Wert-Änderung oder Salzkonzentration von ihnen zu eluieren (siehe Chromatographie). Kalziumphosphatgele, zellbasierte Ionenaustauscher (meistens Anionenaustauscher, zum Beispiel Diethylaminoethylcellulose), Ionenaustauscherharze werden zur Adsorption verwendet. Die Elution des Virus aus Calciumphosphat erfolgt mit Phosphatpufferlösungen steigender Konzentration und aus zellbasierten Ionenaustauschern mit Natriumchloridlösungen.

Hochgereinigte Suspensionen werden durch Zentrifugieren einer Flüssigkeit in einer Säule mit einer Dichte erhalten, die in einem kontinuierlichen Gradienten verteilt ist. Viruspartikel werden auf dem Niveau gesammelt, bei dem die Dichte des Mediums gleich ihrer Fließdichte ist. Die zonale Zentrifugation in einem Saccharosegradienten ermöglicht die Trennung von Partikeln mit unterschiedlichen Massen. Das Material wird auf einen Gradienten aufgebracht, der durch Laminieren der entsprechenden Saccharoselösungen erzeugt wird. Am Ende der Zentrifugation werden Fraktionen gesammelt, die den Boden des Röhrchens durchstechen. In einer Gleichgewichts- oder isopyknischen Zentrifugation werden Viruspartikel in einer Lösung von Cäsiumchlorid, Cäsiumsulfat oder Rubidiumchlorid suspendiert. Nach längerer Zentrifugation wird ein stetiger kontinuierlicher Dichtegradient erzeugt. Je nach Lokalisierungsort der Viruspartikel kann deren Dichte bestimmt werden. Es ist zu beachten, dass die erhaltenen Werte für die Dichte und Masse der Viruspartikel in gewissem Maße von dem bei der Zentrifugation verwendeten Medium abhängen.

Wenn V. und. Viren, die mit verschiedenen radioaktiven Isotopen markiert sind, werden häufig verwendet. Der am häufigsten verwendete Kohlenstoff ist 14 C, Tritium 3 H, Phosphor 32 P, Schwefel 35 S, Jod 131 I. Es ist am einfachsten, das Virus zu markieren, wenn es in Zellkulturen kultiviert wird. Die Radioaktivität wird mit Flüssigszintillationszählern oder durch Autoradiographie bestimmt (siehe).

Chem. die Zusammensetzung der Viren untersucht herkömmliche Chemikalie. durch Methoden. Nucleinsäuren, die normalerweise Phenolextraktion erhalten, seltener verwendete anionische Detergenzien - Dodecyl - oder Natriumlaurylsulfat.

Um Viren zu identifizieren (siehe), sollten Sie zunächst ihre geschlechtliche Identität feststellen. Dazu müssen Größe und Struktur der Viruspartikel, der Typ der Nukleinsäuren in ihrer Zusammensetzung und das Vorhandensein einer Lipoidmembran bestimmt werden. Der Typ der Nukleinsäure wird meistens durch indirekte Verfahren bestimmt, beispielsweise unter Verwendung der Fähigkeit von Bromodeoxyuridin, die Reproduktion von DNA-enthaltenden Viren zu unterdrücken. Das Vorhandensein einer Lipoidhülle in einem Virus wird durch seine Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung von Ether und Chloroform bestimmt (Viren mit einer Hülle werden inaktiviert). Die weitere Identifizierung erfolgt mit einer Reihe von Immunseren gegen bekannte Viren unter Verwendung verschiedener Reaktionen - Neutralisation, CSC, RTGA ua - seltener werden Tiere mit einem bekannten Virus immunisiert und mit einem unbekannten Virus infiziert oder umgekehrt.

Bibliographie: Labordiagnostik von Virus- und Rickettsienerkrankungen, hg. E. Lennet und N. Schmidt, trans. mit Englisch, M., 1974, Bibliogr.; Luria G. E. und Darn Ell J. E. General Virology, trans. aus English, M., 1970, Bibliogr.; Methoden der Virologie und Molekularbiologie, trans. Mit Englisch, M., 1972; П ш e н und ч-н о в V. А., Semenov B.F. iZeze-r über EG, Standardisierung von Methoden virologischer Untersuchungen, M., 1974, Bibliogr.; Richtlinien für die Labordiagnostik von Virus- und Rickettsienerkrankungen, hg. P. F. Zdrodovsky und M. I. Sokolov, M., 1965; MI, S. und N. Sokolov und A.A.Y. und P. Remezov. Virologische und serologische Untersuchungen bei Virusinfektionen, L., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Virologischer Bluttest

Im Zentrum werden mehr als 700.000 Studien durchgeführt, darunter hämatologische, immunologische, virologische, bakteriologische und biochemische Untersuchungen. Insgesamt befinden sich in der Servicestruktur sieben unabhängige Laboreinheiten, die mit einzigartigen Diagnosegeräten ausgestattet sind, die eine Diagnose mit hoher Sicherheit ermöglichen.

(Durchflusszytometer: "Navios", "Epics"; Probenvorbereitungsstationen: PrepPlus 2, TQ-Prep; IF-Analysator - Zenyth340rt; Fluoreszenz- und Lichtmikroskope "OLYMPUS")

Diagnosefunktionen des immunologischen Labors:

Das Labor führt folgende Arten der Forschung durch:

  • Bestimmung der Differenzierungsoberflächenantigene von Lymphozyten CD 3, CD 4, CD 8, CD 20, CD 16, CD 25 durch indirekte Oberflächenimmunfluoreszenz unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops.
  • Bestimmung des Immunophänotyps von Lymphozytenpopulationen und Subpopulationen durch direkte Immunfluoreszenz unter Verwendung einer multiparametrischen Analyse und eines Durchflusszytometers: Bestimmung von T-Lymphozyten CD 45+ CD 3+; T-Helfer / T-Induktoren CD 45+ CD3 + CD4 +; T-Suppressoren / T-cytotoxische CD 45+ CD3 + CD8 +; HLA-DR + -Rezeptoren; T-Lymphozytenaktiv CD3 + HLA-DR +; T-Lymphozyten-aktives CD3 + CD25 +; T-Helfer aktiv CD3 + CD4 + CD25 +; T-regulatorische Zellen CD45 + CD3 + CD4 + CD25 + CD127-; NK-Zellen CD16 + CD56 + CD3-; NKT-Zellen CD 16+ CD56 + CD3 +; B1-Zellen CD19 + CD5 +; B2-Zellen CD19 + CD5-; B-Zelle CD19 +.
  • Bestimmung der Phagozytenfähigkeit von Neutrophilen und der Phagozytenzahl unter Verwendung der Absorption von Latexpartikeln durch Neutrophile.
  • Bestimmung der Gesamtredoxaktivität von Neutrophilen (NBT-Test spontan und aktiviert).
  • Quantitative Bestimmung der Ig-Klassen G, A, M im Serum: durch radiale Immundiffusion im Gel und durch ELISA.
  • Quantitative Bestimmung im Serum durch ELISA: Ig E, Konzentration des Schilddrüsen-stimulierenden Hormons, Gehalt an freiem 3,5,3-Triiodthyronin (T3), Tetraiodothyronin (T4), Interferon - α, γ, Interleukingehalt - 1, 2, 4
  • Bestimmung im Serum mittels ELISA-Methode: Gehalt an Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Antikörper gegen Mitochondrien (AMA-M2), Antikörper gegen Leber- und Nierenmikrosomen (Anti LKM), Antikörper gegen doppelsträngige DNA, alpha-Fetoprotein.

Das Labor ist mit modernen Geräten der neuen Generation ausgestattet: zwei Xiril-Probenvorbereitungsstationen zur automatischen Extraktion von Nukleinsäuren; Vier Echtzeit-PCR-Systeme für die Spot-Detektion: CFX-96 und IQ-5 von BIO-RAD, Abbott 2000 RT von Abbott und DT-lite 48 von DNA-Technologie; ABI Prism 3130 Genanalysator von Applied Biosystems; Ausrüstung für die Arbeit an Agarosegel der Firma BIO-RAD und des UVP-Systems MultiDoc-It-Gel-Dokumentation.

Diagnosefunktionen des PCR-Diagnoselabors:

  • Qualitative und quantitative Bestimmung der RNA und proviralen DNA des Human Immunodeficiency Virus (HIV);
  • RNA und DNA der viralen parenteralen Hepatitis B, C, D, G;
  • Bestimmung der Genotypen des Hepatitis-C-Virus;
  • Bestimmung der HIV-1-Arzneimittelresistenz durch Sequenzierung;
  • Bestimmung der Überempfindlichkeit gegen Abacavir (HLA B * 5701);
  • qualitative Bestimmung der DNA von Toxoplasma gondia;
  • DNA sexuell übertragene Infektionen.

Diagnosefunktionen des ELISA-Labors:

  • Screening-Studien von Blutserum aus Krankenhäusern der Stadt Voronezh und der Region auf HIV-Infektion und parenterale Virushepatitis B, C.
  • Virushepatitis-Marker: HBeAg. Anti-HBeAg. Anti-HBsAg. HBcoreIgM. HCVcoreIgM
  • AIDS-Indikatorerkrankungen: Toxoplasmose, Chlamydien, Pneumocystose, Syphilis, Tuberkulose (Definition von Quantiferon).
  • Definition von AT bis zu Helminthen: Giardia, Toksokar, Echinococcus, Opisthorchiasis, Trichinose.

Das Labor führt über 340.000 Studien pro Jahr durch, darunter 190.000 HIV-Tests, die 40% aller im Feld durchgeführten HIV-Tests ausmachen.

Um die Überwachung und Aufzeichnung der Forschung sicherzustellen, führt das Labor seit 1994 eine HIV-Referenzdiagnostik durch. Jährlich werden etwa 800 Referenzstudien durchgeführt.

Diagnostische Fähigkeiten des Labors für virologische Forschung

Das Labor führt die folgenden Arten von Studien zur Infektionspathologie der viralen Ätiologie durch.

qualitative Bestimmung des Herpesvirus Typ 6, Cytomegalovirus, Herpes Simplex Virus (Typ 1 und 2), Ebstein-Barr Virus; Parvovirus B19

quantitative Bestimmung von Cytomegalovirus, Ebstein-Barr-Virus;

qualitative Bestimmung und Genotypisierung von humanem Papillomavirus mit hohem karzinogenem Risiko;

Identifizierung und Differenzierung von RNA von Rotaviren von Genotypen der Gruppe A, Norovirus 2 und Astroviren im klinischen Material;

  • Nachweis von Antikörpern gegen das Epstein-Barr-Capsid-Antigen (VCA) (Ig M, Ig G, Bestimmung des Aviditätsindex);
  • Nachweis von Antikörpern gegen Cytomegalovirus (IE-AT Ig M, Ig G, IE-AT Ig M, Ig G, IgG-Aviditätsindex der Antikörper);
  • Nachweis von Antikörpern gegen Herpes-simplex-Virus (Ig M, Ig G, Aviditätsindex der Antikörper der IgG-Klasse);
  • Immunoenzym-Nachweis von Immunglobulinen der Klasse G mit dem humanen Herpesvirus Typ 6, Herpesvirus Typ 8.
  • Immunofermentaler Nachweis von Rotavirus-Antigen und humanem Adenovirus (aus Kot).
  • Nachweis von Antikörpern gegen den Erreger des Rötelnvirus (Ig M, Ig G, Bestimmung des Aviditätsindex der Antikörper der IgG-Klasse); Gegebenenfalls erfolgt der Nachweis von Rötelnvirus-RNA (Rötelnvirus) im klinischen Material mittels PCR

So bestimmen Sie die Intensität der Immunität:

  • Nachweis von Antikörpern gegen den Erreger des Masernvirus (Ig G).
  • Nachweis von Antikörpern gegen den Erreger des Mumps-Virus (Ig G.

In der Epidemiesaison plant das Labor die folgenden Arten von Forschung:

  • RNA-Nachweis von Influenza-A-Viren (Influenzavirus A) und Influenza B (Influenzavirus B) in klinischem Material mittels PCR mit Hybridisierungs-Fluoreszenz-Nachweis.
  • Nachweis von Erregern akuter humaner respiratorischer Virusinfektionen (ARVI): RNA des Respiratory Syncytial Virus (humanes Respiratory Syncytial Virus - hRSv), humanes Metapneumovirus (hMpv), humanes Metapneumovirus - hMv-Virus, Parainfluenzavirus 1, 2, 3 und 4 4 - hPiv), Coronaviren (humanes Coronavirus - hCov), Rhinoviren (humanes Rhinovirus - hRv), DNA von Adenoviren der Gruppen B, C und E (humanes Adenovirus B, C, E - hAdv) und Bocavirus (humanes Bocavirus - hBov) das Material durch die Methode der Polymerase-Kettenreaktion mit Hybridisierungs-Fluoreszenz-Nachweis.

Das Labor führt folgende Arten der Forschung durch:

1. Für pathogene Mikroorganismen.

  • Mikrobiologische Untersuchung von Biomaterialien auf Infektionen in der Luft (Keuchhusten, Parakoklosis, Meningokokken, Diphtherie)
  • Mikrobiologische Untersuchung von Darminfektionen von Biomaterialien (Salmonellose, Shigellose, Escherichiose).

2. Auf bedingt pathogene Mikroorganismen.

  • Mikrobiologische Untersuchung: Blut auf Unfruchtbarkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Galle, Urin, Ausfluss (Atemwege, Augen, Ohren, Genitalien, oberflächliche und tiefe Wunden, Knochen und Gelenke bei infektiösen Entzündungsprozessen), Punktat, Exsudate, Synovialflüssigkeit, Dysbakteriose, Muttermilch, Autopsiematerial, Biomaterial für hefeartige Pilze (Candida spp.) und Schimmelpilze (Aspergillus spp.).

3. Bestimmung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika (Verdünnungsmethode), Antiseptika und Desinfektionsmitteln.

4. Serologische Studien zu Salmonellose, Shigellose, Pseudotuberkulose, Yersiniose, Typhus, Keuchhusten und Parakoklosis, Tularämie-Brucellose.

5. Hygienebakteriologische Studien:

  • Raumluftgesundheitseinrichtungen
  • Umgebungsobjekte durch Spülen
  • Sterilität von Medizinprodukten, Verbandmaterial, Nahtmaterial usw.

Das Labor ist mit einer Ausrüstung zur Bestimmung der wichtigsten Parameter der klinischen Biochemie ausgestattet:

  • Glukose,
  • ASAT,
  • ALAT,
  • Alpha-Amylase,
  • Gesamtbilirubin
  • Assoziiertes Bilirubin,
  • Freies Bilirubin,
  • Kreatinin,
  • Alkalische Phosphatase
  • Harnstoff,
  • LDH,
  • KFK,
  • Lipase
  • Gesamtprotein
  • Cholesterin
  • Gamma-Glutamyltransferase,
  • Albumin,
  • Triglyceride,
  • Cholesterin HDL,
  • LDL-Cholesterin
  • Harnsäure
  • Prothrombinzeit
  • Prothrombin für Kvik,
  • INR,
  • PI,
  • APTTV,
  • Fibrinogen,
  • Kalium,
  • Natrium,
  • Kalzium,
  • Magnesium.

Virologische Forschungsmethoden

Virologische Forschungsmethoden werden in der Medizin häufig zur Diagnose einer Vielzahl von infektiösen und einigen onkologischen Erkrankungen viraler Natur eingesetzt.

Virologische Forschungsmethoden werden auch verwendet, um Viren zu identifizieren, ihre Biologie zu studieren und ihre Fähigkeit, auf tierische und menschliche Zellen zu wirken, zu untersuchen. Dies hilft weiter, die Pathogenese von Viruserkrankungen zu verstehen und die richtigen Methoden für ihre Behandlung zu wählen. Virologische Forschungsmethoden sind neben der Etiologie der Krankheit und der Überwachung der Wirksamkeit der Therapie von großer Bedeutung für die Bestimmung und Durchführung von antiepidemischen Maßnahmen.

Direkte Forschungsmethoden in der Virologie

Direkte virologische Forschungsmethoden ermöglichen den Nachweis eines Virus, einer viralen Nukleinsäure oder eines viralen Antigens direkt im klinischen Material und sind somit die schnellsten (schnelle Methoden - bis zu 24 Stunden). Diese Methoden sind weniger informativ und erfordern eine Laborbestätigung indirekter Diagnoseverfahren im Zusammenhang mit dem häufigen Erhalten falsch-negativer oder falsch-positiver Ergebnisse. Direkt schließen Sie folgende Forschungsmethoden ein:

  • Elektronenmikroskopie mit Virusfärbung durch negatives Kontrastieren (ermöglicht die Bestimmung des Vorhandenseins des Virus und seiner Konzentration im Material, vorausgesetzt, dass 1 ml mindestens 105 Viruspartikel enthält);
  • Immunelektronenmikroskopie basierend auf der Wechselwirkung spezifischer Antikörper mit Viren unter Bildung von Komplexen, die mit negativem Kontrast leichter nachzuweisen sind als separate Viren;
  • Enzymgebundener Immunosorbent-Assay (ELISA) unter Verwendung von Enzym-markierten Antikörpern, die an Antigene binden, wodurch Komplexe gebildet werden, die durch Zugabe eines Substrats für das verwendete Enzym nachgewiesen werden;
  • Die Immunfluoreszenzreaktion (RIF) - direkt oder indirekt - basiert auf der Verwendung von Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff assoziiert sind.
  • Die Radioimmunanalyse (RIA) basiert auf der Verwendung von Radioisotop-markierten Antikörpern und Gammazählern.
  • zytologische Methoden basieren auf der mikroskopischen Untersuchung gefärbter Abstriche, Biopsien, Autopsiematerialien;
  • molekulare Methoden - molekulare Hybridisierung von Nukleinsäuren und Polymerase-Kettenreaktion (die erste basiert auf der Identifizierung komplementärer Nukleinsäurestränge unter Verwendung einer Markierung, die zweite basiert auf dem Replikationsprinzip der virusspezifischen DNA-Sequenz in drei Stufen).

Es gibt drei Optionen für die molekulare Hybridisierung von Nukleinsäuren - Punkt-Hybridisierung, Blot-Hybridisierung (zur Diagnose einer HIV-Infektion) und In-situ-Hybridisierung (direkt in infizierten Zellen). PCR (Polymerasekettenreaktion) wird aufgrund der hohen Empfindlichkeit und Spezifität dieser Methode zunehmend zur Überwachung und Diagnose von Virusinfektionen eingesetzt.

Indirekte virologische Forschungsmethoden

Diese Methoden basieren auf der Isolierung und Identifizierung des Virus. Dies sind zeitaufwendigere und langwierigere Techniken, jedoch genauer. Das Material für solche Untersuchungen kann der Inhalt der Vesikel, Kratzen (mit Windpocken, herpetischen Läsionen der Haut und Schleimhäute), Nasopharynxspülung (mit Atemwegsinfektionen), Blut und Flüssigkeit (mit Arbovirusinfektionen), Kot (mit enteroviralen Infektionen), Spülungen (mit) sein Masern, Röteln usw.). Da sich Viren nur in lebenden Zellen vermehren können, erfolgt die Kultivierung des Virus in Gewebekultur, Hühnerembryo oder in einem Tier (Hamster, Weiße Maus, Hund, Katze, einige Affenarten). Die Anzeige des Virus erfolgt durch zytopathische Wirkung, in der Hämadsorptionsreaktion, im Farbtest, durch die Ergebnisse der Hämagglutinationshemmungsreaktion, durch Änderungen oder deren Abwesenheit in Hühnerembryos oder Gewebekulturen, durch Überleben empfindlicher Tiere.

Serologische Diagnosemethoden in der Virologie

Unter der serologischen Diagnose versteht man virologische Forschungsmethoden, die auf der Reaktion von Antigen-Antikörpern basieren. In diesem Fall handelt es sich um das am häufigsten verwendete gepaarte Serum, das im Abstand von mehreren Wochen eingenommen wird. Bei einem Anstieg des Antikörpertiters 4 oder mehr wird die Reaktion als positiv betrachtet. Um die Typspezifität von Viren zu bestimmen, wird die Virusneutralisationsreaktion verwendet, um die Gruppenspezifität, die Reaktion der Komplementbindung, zu bestimmen. Weit verbreitet sind auch Reaktionen der passiven Hämagglutination, Hemmung der Hämagglutination, inverse passive Hämagglutination, FTA und verschiedene Optionen für den Enzymimmunoassay.

In letzter Zeit wurde im Rahmen der gentechnischen Forschung eine Technik zur Herstellung monoklonaler Antikörper entwickelt. Die enge Spezifität von Monokonen wird durch die Verwendung mehrerer monoklonaler Antikörper gegen verschiedene virale Determinanten überwunden. Dies erhöhte die Sensitivität und Spezifität virologischer Forschungsmethoden mit der Bestimmung viraler Antigene. Gegenwärtig sind viele verschiedene Testsysteme für die immunologische Diagnose von Virusinfektionen geschaffen worden.

Infektion des Menschen

Überschriften

  • Bakterielle infektionen (41)
  • Biochemie (5)
  • Virushepatitis (12)
  • Virusinfektionen (43)
  • HIV-AIDS (28)
  • Diagnose (30)
  • Zooanthroponotische Infektionen (19)
  • Immunität (16)
  • Infektionskrankheiten der Haut (33)
  • Behandlung (38)
  • Allgemeinwissen über Infektionen (36)
  • Parasitäre Krankheiten (8)
  • Richtige Ernährung (41)
  • Prävention (23)
  • Andere (3)
  • Sepsis (7)
  • Standards für die medizinische Versorgung (26)

Auswahl von pathologischem Material für virologische Studien

Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Isolierung des Virus ist die korrekte Sammlung von pathologischem Material und dessen Transport ins Labor.

  • Wählen Sie das Material so früh wie möglich nach dem Einsetzen der Krankheit aus und befolgen Sie die Regeln der Asepsis und der Sicherheit.
  • Das Material wird in einem sterilen Behälter aufgenommen, in ein Transportmedium für Viren (BTC) gebracht und fest verschlossen.
  • Bei der Durchführung von Manipulationen sollten medizinisches Personal und Techniker persönliche Schutzausrüstung verwenden.

Regeln für die Auswahl von pathologischem Material.

Rückenmark - Hirnflüssigkeit

Nehmen Sie 1-2 ml eines sterilen Röhrchens und schließen Sie den Gummistopfen. Verunreinigungen von roten Blutkörperchen und anderen Zellelementen werden durch Zentrifugation entfernt, Viren werden aus dem Überstand isoliert.

Eine durchschnittliche Portion Urin in einem Volumen von 10 ml sammeln, auf 4 ° C abkühlen, zentrifugieren, in 1 ml Transportmedium für Viren ablegen.

Blut

Nehmen Sie für eine virologische Studie aus einer Vene in einem Volumen von 5-10 ml, vorzugsweise während der Fieberperiode, 1 IE Heparin zu 1 ml Blut. Für serologische Tests - Blut aus einer Vene in einer Menge von 3-5 ml bis zu einem trockenen Röhrchen (um gepaarte Seren zu erhalten, wird in Intervallen von 12-14 Tagen Blut entnommen), wird das Serum durch Absetzen oder Zentrifugieren gewonnen.

8-10 g Kot werden in ein steriles Gefäß gegeben und mit einem Gummistopfen verschlossen. Die resultierenden Fäkalien, verdünnt mit Hanks-Lösung im Verhältnis 1:10, wurden 3-5 Minuten geschüttelt, zentrifugiert. Um das Virus zu isolieren, wird der Überstand gesammelt.

Flüssigkeit aus serösen Hohlräumen. Nehmen Sie ein Volumen von 2 ml auf. Zur Virusisolierung wird es sofort verwendet oder eingefroren aufbewahrt.

Abstrich von der Konjunktiva. Nehmen Sie einen trockenen Wattestäbchen und legen Sie ihn in ein Transportmedium für Viren (BTC).

Der Inhalt der Vesikel. Die Hautoberfläche wird mit Äther behandelt, der Inhalt der Vesikel wird mit einer dünnen Nadel abgesaugt und in das PTS übertragen.

Schnittmaterial. Wird frühestens nach dem Tod des Patienten ausgewählt. Zunächst werden Proben aus extrakavitären Geweben entnommen, dann Gewebe der Brusthöhle und zuletzt - aus der Bauchhöhle. Gewebeteile mit einem Gewicht von 1-3 g werden in separate sterile Durchstechflaschen gegeben.

Für die sanitärvirologische Forschung wird Material aus der Umwelt ausgewählt: Boden, Wasser, Milch und Milchprodukte, Gemüse, Obst, lebende Organismen (Milben, Mollusken, Fisch usw.). Die Einführung einer virologischen Überwachung von Umweltobjekten ist notwendig, um die Intensität der Zirkulation von Viren in einem bestimmten Gebiet und ihre typische Zusammensetzung zu bestimmen und die Wirksamkeit der Arbeit zur Verbesserung der Umwelt zu bewerten.

Regeln für die Einnahme von pathologischem Material mit Influenza, ARVI:

1. Legen Sie 3 Röhrchen in ein Rack und markieren Sie sie - ein Röhrchen mit Hanks-Lösung (Nummer der Analyse) und zwei Röhrchen mit sterilen Wattestäbchen - „H“ und „Z“.

2. Setzen Sie den Patienten bequem ein.

3. Bitten Sie den Patienten, die Nase vom Schleim zu befreien.

4. Nehmen Sie einen Tampon mit der Markierung „H“ in die rechte Hand und führen Sie ihn 2-3 cm tief in die Nasenhöhle des Patienten ein. Drücken Sie die Außenwand der Nase mit einer Drehbewegung und entfernen Sie das abgelöste Epithel.

5. Geben Sie den gleichen Tampon in den anderen Nasengang ein und nehmen Sie das Material auf die gleiche Weise.

6. Tauchen Sie einen Tampon in Hanks-Lösung, waschen Sie ihn gründlich ab und drücken Sie ihn auf die Röhrchenwände. Schließen Sie die Lösung mit einem Stopfen.

7. Legen Sie den Tupfer in ein mit „H“ gekennzeichnetes Reagenzglas.

8. Lassen Sie den Patienten den Mund weit öffnen.

9. Nehmen Sie einen sterilen Spatel in die linke Hand und drücken Sie ihn auf die Zungenwurzel. Es ist wichtig, keinen Würgereflex zu verursachen!

10. Nehmen Sie in der rechten Hand den zweiten Tupfer mit der Markierung „3“ und wählen Sie das Material von der Rückseite des Halses aus.

11. Tauchen Sie einen Tampon mit Hanks-Lösung in dasselbe Röhrchen, waschen Sie ihn und drücken Sie ihn gegen die Wand dieses Röhrchens. Legen Sie den Tampon in ein Reagenzglas, auf dem "Z" angezeigt wird. Schließen Sie es mit einem Korken.

12. Verschließen Sie die Kappe und die Oberseite des Rohrs mit Hanks-Medium mit Klebeband.

13. Füllen Sie die Richtung und Nummer gemäß der Nummerierung auf dem Röhrchen ein und legen Sie sie in eine Plastiktüte.

14. Bringen Sie das für die Forschung verwendete Material in einen wärmeisolierenden Behälter, bringen Sie eine Packung mit einer Anleitung an und transportieren Sie sie zum Virologielabor.